�@　リンパ球刺激と培養

患者さんから得られる材料等の条件により、以下のように刺激の仕方が異なってきます。

CD3 分子は T 細胞表面で抗原を認識する T 細胞受容体の一部を構成する分子で、 T 細胞を抗 CD3 抗体で刺激すると T 細胞一般があたかも抗原刺激を受けたかのような影響を受けます。実際には抗 CD3 抗体を固着させた培養フラスコを用いて培養を行うと、 T 細胞にこのような刺激を与えることが出来ます。

IL-2 は T 細胞の増殖・活性化の因子で、遺伝子工学的に作られたものを使用します。 IL-2 を培養液に加えると T 細胞表面にある IL-2 受容体に結合してリンパ球の中でも T 細胞の増殖が起こります。

培養の前半で上記のような刺激をリンパ球に加え、培養液を段階的に増やしながら炭酸ガス培養器中で培養を続け、培養後半は比較的低濃度の IL-2 を含む培養液と炭酸ガス透過性のバッグを使用して、約２週間培養を続けます。血液約 23ml から得られたリンパ球を増殖させ、標準的には最終的に 2.4 リッターの培養とし、遠心分離によりリンパ球を回収し、洗浄します。培養の開始、中間および最終に無菌試験と発熱物質の混入についての試験を行い、陰性だった場合に患者さんに戻します。

患者さんの胸水、腹水を無菌的にいただける場合には、その中に存在するがん細胞を用いてより有効な刺激を行うことが出来ます。

この場合、培養初期の刺激として の IL-2 や抗 CD3 抗体を使わずに自分のがん細胞だけで刺激を与えて培養します。
その後 IL-2 と抗 CD3 抗体を と同様に用いて培養を行います。
このようにして得られた培養リンパ球は、患者さん自身のがん細胞に対する特異性を持った細胞障害性 T 細胞（ cytotoxic T lymphocyte 、 CTL ）を多く含みます。

腹水から遠心分離によりがん細胞を分離して、細胞凍結保存用の培養液を用いて細胞浮遊液とし、液体窒素中で凍結保存します。使用時に解凍すれば生きた細胞が得られ、これを用いてリンパ球の活性化と培養を行うことが出来ます


　

樹状細胞（ Dendritic cell, DC ）は T 細胞に対する抗原提示を専門に行う細胞です。

血液より比重遠心法で得られたリンパ球画分に含まれる単球を分離し、これを GM-CSF および IL-4 を添加した培地中で培養して、樹状細胞に分化させることが出来ます。これにがん細胞から抽出した蛋白質を貪食させると、取り込まれたがん抗原蛋白質が細胞内で分断されて異常ペプチドを生じ、これが抗原として樹状細胞表面に提示されます。